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免疫印跡(Western blotting)實驗原理、試劑和操作步驟
發布時間:2022-06-14   點擊次數:79次

 (一)原理

Western blot是一種在PVDF或硝酸纖維素(NC)膜上進行的抗原抗體反應。蛋白電泳后,將蛋白轉移至膜上,再與特異性抗體孵育,洗去游離的抗體,然后和酶標記的二抗孵育,再進行底物顯色。由于抗原抗體反應特異性好,親合力高,Western blot檢測的靈敏度較高,尤其是采用酶促增強化學發光的方法(ECL)后,檢測的下限可達到pg水平。ECL是指酶催化底物發熒光,熒光可使X光片曝光。由于酶標記在二抗上,二抗與一抗結合,而一抗特異性結合在目的蛋白條帶處,因此顯影、定影后觀察到的條帶即為目的蛋白帶。


(二)試劑和材料

1. PVDF膜或NC膜。

2.電泳緩沖液:25 mM Tris堿、250 mM甘氨/酸、0.1%SDS。

3.轉移緩沖液:實驗所用的PVDF或NC膜不同,轉移緩沖液也可能不同,因此請仔細參閱PVDF或NC膜說明書。

4.TBS(pH7.5):6.05 g Tris堿(50mM)、8.76g NaCl(150mM)溶于800 ml雙蒸水,用 HCl調 PH至7.5,補加水至1L。

5.TBST:TBS+0.1%(v/v)Tween 20。

6.封閉液:1%試劑盒中的封閉液,或5%脫脂奶粉,溶于TBS中。

7.解離液:100 mM 二巰基乙醇、2%SDS。

8.化學發光Western blot試劑盒:生產這類試劑盒的公司包括 Roche、Pierce、Amersham 等,試劑盒中一般包括酶標記二抗、發光波A和B。

(三)操作步驟

1. 灌制SDS-PAGE電泳膠,方法參見一般的分子生物學實驗方法。

2. 取免疫沉淀最后所得的上清,上樣,電泳。

3. 用電轉移裝置將蛋白轉至PVDF或NC膜上。

4. 電轉移完畢后,取出膜,用TBS洗滌1次。

5. 將膜放入封閉液 于室溫封閉1 h, 或4℃封閉過夜。

6. 用封閉液稀釋識別目的蛋白的抗體至1-10 ug/ml,與含有目的蛋白條帶膜在室溫作用1 h。

7. TBST洗膜4次,每次15 min。

8. 按試劑盒說明書稀釋酶標記二抗,與膜于室溫作用30min。

9. TBST洗膜4次,每次15 min。

10. 按試劑盒說明書混合發光液A和B,與膜作用1 min后進行X光片曝光。

11. X光片顯影和定影后觀察結果。

12. 如果結果不理想或要用相同的膜檢測另一種靶蛋白,可將膜與解離液于50℃作用30 min,去除結合于膜上的抗體, TBST洗2次,封閉后可重新檢測(即重復 6-11步)。

(四) 注意事項

1.用于 Western blot和免疫沉淀的抗體最好不同,否則將出現很多非特異性條帶。

2. Western blot中,轉移在膜上的蛋白處于變性狀態,其空間結構被改變,因此那些識別空間表位的抗體不能用于Western blot檢測。這種情況下,可將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生/物素化,再用抗體進行免疫沉淀,得到的生/物素化的目的蛋白可用酶標記親和素進行Western blot檢測。

3.化學發光法檢測的敏感度很高,實驗中取膠和膜必須帶一次性手套。

4. 曝光、顯影和定影需在暗室中進行,X光片用完后一定要收好,避免曝光。

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