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純化凝膠選擇的具體方法
發布時間:2022-06-13   點擊次數:61次

生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學特性,然后通過實驗選擇出有效的純化流程。

測定——分子量、PI

當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時,可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離范圍廣闊的Superose HR預裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同PH緩沖液的試管中,可簡易地測出PI,并選擇純化用緩沖液的最佳PH。

選擇——層析方法

若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解,可嘗試幾種不同的純化方法:

1. 使用通用的凝膠過濾方法,選擇分離范圍廣闊的介質如Superose、Sephacryl HR依據分子量將 樣品分成不同組份。

2.用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物、受體等自制親和介質,再用以結合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。

3. 體積大的樣品,往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品,可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理,洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。

純化——大量粗品

處理大量原液時,為避免堵塞柱子,一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAmlINE介質,直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一。提高回收率,縮短純化周期。

純化——硫酸氨樣品

硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品,經處理過的樣本處于高鹽狀態下,很適合直接上疏水層析。若作離子交換,需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術,隨著介質種類不斷增多,漸被融入各生產工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質中選擇適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。

純水——糖類分子

固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素,可結合碳水化合物的糖類殘基,很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器,純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質,專為俘獲整個細胞或大復合物,如膜囊等。

純化——膜蛋白

膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白相反電荷者,避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質,籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。

純化——單抗、抗原

單抗多為IgG。來源主要是腹水和融合瘤培養上清液。腹水有大量白蛋白、轉鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對IgG的Fc區有專一性親和作用,能一步純化各種不同源的IgG。血清互補劑如小牛血清可先用蛋白G預處理,在培養前除去IgG。重組蛋白A介質 Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性,基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200,很容易去除。

疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。

純化IgG抗原有效的方法是用活化偶聯介質如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯IgG,再進一步獲取IgG抗原。

HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養的單抗IgM,結合量達5mg IgM。HiTrap IgY是專門用來純化IgY,結合量達100mg純IgY。

純化——重組蛋白

重組蛋白在設計、構建時應已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物,擴張柱床吸附技術STREAmlINE便很適合做粗分離。 Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統。

GST融合載體使要表達的蛋白轉移酶一起表達,然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化,再利用凝血mei或因子Xa切開。

蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達,以IgG Sepharose 6 FF純化。


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