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蛋白質的鹽析與透析實驗
發布時間:2022-05-27   點擊次數:153次

一、實驗目的
(1)掌握蛋白質鹽析沉淀的基本原理與操作。
(2)掌握蛋白質透析分離的基本操作。

二、實驗原理
蛋白質是親水膠體,借助水化膜和同性電荷(在pH7.0的溶液中一般蛋白質帶負電荷)相互排斥作用維持蛋白質膠體的穩定,向蛋白質溶液中加入中性鹽可破壞這些穩定因素,使蛋白質沉淀析出,稱為鹽析。鹽析所得到的蛋白質沉淀經透析或用水稀釋以減低或除去鹽后,蛋白質能再次溶解并恢復其天然結構和生物活性,稱為透析。由于蛋白質分子量很大,其顆粒直徑范圍在1~100nm內,不能透過半透膜。選用合適孔徑的半透膜可使小分子物質透過,而蛋白質不能透過半透膜,從而可以除去與蛋白質混合的中性鹽及其他小分子物質。蛋白質鹽析常用中性鹽,如硫酸銨、硫酸鈉、NaCl等。蛋白質經鹽析沉淀后,需脫鹽才能獲得純品。脫鹽常用的方法為透析法。由于蛋白質分子量較大,不能透過半透膜,而無機鹽及其他低分子物質可以透過,故利用透析法可將鹽析得到的蛋白質進行純化。將蛋白質溶液裝入透析袋內,袋口用線扎緊,然后將其放進蒸餾水中,蛋白質分子量大,不能透過透析袋而被截留在袋內,而小分子鹽由于透析袋內外濃度差,可透過透析袋,通過不斷更換袋外蒸餾水,直至袋內鹽分透析完為止。透析常需較長時間,為保證蛋白質不變性,透析宜在低溫下進行。

三、實驗材料與試劑
1.實驗材料
10%雞蛋清溶液,含雞蛋清的氯化鈉蛋白質溶液。

2.主要實驗試劑
飽和硫酸銨溶液:稱取固體硫酸銨850g加入1000mL蒸餾水中,在70~80℃下攪拌溶解,室溫放置過夜,杯底析出白色晶體,上清液即為飽和硫酸銨溶液。硫酸銨晶體、1%肖酸銀溶液等。

四、實驗步驟
1.透析袋的預處理
為防干裂,新透析袋出廠時常用10%甘油進行處理,并含少量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質,需除去。將透析袋剪成100~120mm的小段,用50%乙醇煮沸1h,再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氫那和0.001mol/LEDTA溶液洗滌,最后用蒸餾水沖洗3~5次(新透析袋如不作上述特殊處理,也可用沸水煮5~10min,再用蒸餾水洗凈即可使用)。透析袋一端用橡皮筋或線繩扎緊,也可用特殊的透析袋夾夾緊,從另一端灌滿水,用手指稍加壓,檢查是否有滲漏,沒有滲漏后方可使用。處理好的透析袋保存于蒸餾水中待用。

2.蛋白質鹽析
取10%雞蛋清溶液5mL于試管中,加入等量飽和硫酸銨溶液,微微搖動試管,使溶液混合后靜置數分鐘,蛋清蛋白質即可析出。如無沉淀可再加少許飽和硫酸銨溶液,觀察蛋白質的析出。取少量沉淀的蛋白質,加水稀釋,觀察沉淀是否會再次溶解。

3.蛋白質的透析
注入含雞蛋清的氯化鈉蛋白質溶液5mL于透析袋中,將袋的開口端用線扎緊,并懸掛在盛有蒸餾水的燒杯中,開口端位于液面之上。10min后,自燒杯中取出1mL溶液于試管中,加1%肖酸銀溶液一滴,如有白色氯化銀沉淀生成,則證明蒸餾水中有Cl-存在。再自燒杯中取出1mL溶液置于另一試管中,加入1mL10%氫氧化鈉溶液,然后滴加1~2滴1%硫酸銅溶液,觀察有無藍紫色出現。每隔20min更換蒸餾水一次,數小時后可觀察到透析袋內出現輕微混濁,此為蛋白質沉淀。繼續透析至蒸餾水中不再生成氯化銀沉淀為止。實驗記錄透析完成所需的時間。

五、注意事項
蛋白質溶液用透析除鹽時,正負離子透過半透膜的速度不相同,如(NH4)2SO4中的 透析速度快,而透析過程中膜內的 會生成H2SO4,使膜內蛋白質溶液呈酸性。因此,為避免蛋白質變性,用鹽析法純化蛋白質時,開始時應用0.1mol/L的NH4OH透析。此外,為了保證蛋白質在透析過程中不發生變性,可以將透析過程置于低溫下進行。

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