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分子篩(凝膠過濾層析)的優缺點
發布時間:2022-05-27   點擊次數:87次

分子篩定義
分子篩層析,又稱為凝膠過濾層析或體積排阻層析。分子篩層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相,對混合物中各組分按分子大小進行分離的層析技術。具有分子篩作用的物質很多,如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。

避開原因一:工藝放大困難
分子篩層析無法遵循線性放大原則,即使遵循柱床高度不變的原則,工藝流速如何進行調整,也是需要面臨的問題。為保證良好的分離效果,分子篩層析必須要求相對較高的裝填高度,然而裝填高度偏高,反壓也勢必會偏高。由于層析填料的耐壓有限,在保證不超壓的前提下,工藝流速會明顯受限,這會使得整個純化過程時間漫長。

避開原因二:層析柱裝填困難
在進行層析柱裝填時,勻漿液濃度必須在一定的范圍內(50%-70%),方可保證沉降均勻、柱效良好,這對層析柱的規格選型有著特殊要求。高度100 cm的層析柱,在勻漿濃度50%-70%時,假設壓縮系數為1.15,則實際使用高度為43.5-60.9 cm,這往往無法達到某些使用者的要求。若選配裝柱器,并考慮柱頭所占空間,這要求實驗空間必須高度充足。若考慮將2根層析柱串聯使用,則要求2根層析柱的柱效相當,才可保證分離效果良好,這對裝填技術也有著較高要求。

避開原因三:測定柱效困難
常規柱效測定方法,要求平衡1.5-2 CV,進樣后,洗脫至出峰(參考值:2 CV),流速30 cm/h。若假設裝填高度為60 cm,平衡、洗脫體積總計3.5 CV,經計算,測定一次柱效,需耗時7小時??梢韵胂?,當發現柱效不理想,需要重新裝填并測定柱效時,過程是極為繁瑣、耗時的。

避開原因四:維護保養操作困難
當層析柱使用完畢,用20%乙醇保存時,同樣也極為耗時。而且當再次使用時,用水將20%乙醇置換走,一般需要3 CV以上,而且由于該過程反壓較大,通常還需要降低流速進行。
總之,采用分子篩層析,各個環節都極為繁瑣、耗時,因此,在進行層析工藝設計時,要盡量避開分子篩層析。

應用領域
分子篩層析也并非一無是處,其應用領域主要包括以下方面:

1)脫鹽:
高分子(如蛋白質、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質,可以用分子篩層析除去,這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速,蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易失活,樣品體積可達柱床體積的25%-30%,為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上,一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡,然后加入樣品,再用同樣緩沖液洗脫,收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發性鹽類。

2)分離提純:
分子篩層析已廣泛用于酶、蛋白質、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質的分離提純。

3)測定高分子物質的分子量:
用一系列已知分子量的標準品放入同一凝膠柱內,在同一條件下層析,記錄每一分鐘成分的洗脫體積,并以洗脫體積對分子量的對數作圖,在一定分子量范圍內可得一直線,即分子量的標準曲線。測定未知物質的分子量時,可將此樣品加在測定了標準曲線的凝膠柱內洗脫后,根據物質的洗脫體積,在標準曲線上查出它的分子量。

4)高分子溶液的濃縮:
通常將Sephadex G-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中,這時水分和低分子量的物質就會進入凝膠粒子內部的孔隙中,而高分子物質則排阻在凝膠顆粒之外,再經離心或過濾,將溶脹的凝膠分離出去,就得到了濃縮的高分子溶液。


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