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古朵生物:轉染實驗技巧了解一下!
發布時間:2021-10-11   點擊次數:32次
  轉染可謂是做生物學實驗的大家經常會考慮的一項實驗技術,大致原理也都是明白的。到底轉染是什么呢,為什么轉染效率不高呢,今天我們就來一起討論一下其中奧妙吧。
 
  轉染,就是在真核細胞里導入具有生物功能的核酸,并在細胞中維持其生物功能。
 
  轉染方法的選擇
 
  我們熟知且常用的轉染方法主要有物理介導,化學介導,生物介導。但實驗室使用較多的主要有化學介導中的脂質體轉染(質粒轉染)和生物介導中的慢病毒轉染法。其中質粒轉染操作簡單,一般瞬時轉染選擇較多,但有些細胞系不容易轉染,因此選擇轉染方式時一定要做足功課,親身經歷告訴我,千萬不要圖方便,否則轉染效率簡直崩潰。特別是養原代細胞的小伙伴,一點要認真選擇!病毒轉染一般具有能夠穩定表達的優勢,且其對原代細胞有較高的轉染效率,其中更分為慢病毒轉染,逆轉錄病毒轉染和腺病毒轉染,其中腺病毒轉染可適合更為難轉染的細胞,例如懸浮細胞、T細胞、raw細胞等難轉染細胞。
 
  轉染技術的注意事項
 
  1、細胞狀態
 
  眾suo周知,細胞的生長狀態影響實驗結果,原代細胞和傳代次數多的細胞都不是最佳選擇,處于對數生長期的細胞生長狀態最好,最shi合轉染。同時,我們都知道細胞的密度不宜過大,大家往往注意的都是轉染前的密度,失敗過很多次的經歷告訴大家,轉染后的細胞密度更加重要。有時候轉染時間太久,等到進行后續實驗時細胞已經肆意生長,漂起來了,豈不前功盡棄,流著眼淚也要告訴大家,考慮好細胞的生長周期和轉染的時間進行鋪板,建議選擇50%~80%區間密度進行細胞轉染。
 
  2、實驗污染
 
  跟細胞有關的實驗當然要注意不能污染啦,細菌,真菌,支原體都是應該嚴格注意的,不僅會浪費試劑,也會影響實驗結果。(注:支原體污染不易觀察到,轉染前可用環丙沙星處理避免污染)
 
  3、轉染試劑的處理
 
  質粒轉染:1. 質粒的純度會影響轉染的效率,如果質粒不純,其含有少量的鹽,蛋白會嚴重影響轉染復合體的形成,因為內毒素嚴重影響轉染效率,還需進行質粒內毒素的處理。
 
  2. 其次如選用lipo2000或lipo3000,需注意嚴格按照說明書的加樣順序添加,其中mix well只需用槍輕輕混勻或手指輕輕晃動,切忌用力吹打,會導致脂質體失去作用。
 
  3. 質粒轉染時需用無血清的Opti-MEM Medium,關于是否嚴格控制雙抗,最hao咨詢一下轉染試劑廠家技術,本實驗室用的lipo3000咨詢過技術支持,說使用雙抗并不影響轉染效率,害怕污染的小伙伴們可以放心使用啦。
 
  穩轉株的篩選
 
  根據不同的實驗需求,如需進行劃痕,transwell等培養時間較長的實驗,最好使用穩轉細胞株,而我的實驗最后收細胞只需檢測相應蛋白的表達不用較長時間培養,選擇瞬轉即可。質粒轉染一般是瞬時轉染,如需篩選穩定株需要在藥物的作用下,因常用質粒載體pcDNA3.1,其含有neomycin的基因,可選擇G418進行篩選,根據教程需要提前對不同濃度的G418進行細胞篩選,選擇最適篩選濃度,提供一個小tip!可以通過閱讀文獻,選擇一定的濃度區間大梯度進行篩選,在全部存活和死亡較多的兩個濃度間再設定濃度梯度進行篩選,這樣得出的篩選濃度更為準確。同時由于基因轉染進入細胞內需要一定時間才能夠表達出相應的蛋白質,但如果轉染時間較長,細胞代謝時間較久,轉染細胞也會逐漸減少,因此要合理控制進行篩選的時間。注意:藥物篩選時細胞密度不要太低,否則密度太低全部篩死就可以快樂地進行下一次實驗了。
 
  轉染效率的驗證
 
  1、最有效的驗證方式必須是qPCR驗證
 
  2、熒光觀察,使用病毒轉染,明白自己病毒的情況,是熒光標記(一般是GFP)還是非熒光標記。質粒轉染,可以在載體上添加熒光標記,幫助自己通過熒光觀察轉染效率。但是熒光并不能完全證明轉染效率,還是通過核酸驗證最為準確。

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