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古朵實驗: 質粒提取實驗步驟
發布時間:2020-06-22   點擊次數:523次

實驗原理

現在較常用的質粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法,前兩種方法較為劇烈,適用于較小的質粒(<15Kb),而去污劑裂解法則比較溫合,一般用于分子量較大的質粒(>15Kb)。

堿裂解法是一種guang泛使用的制備質粒DNA的方法。其原理為:染色體DNA遠大于質粒DNA,且染色體DNA為線狀分子,而質粒為共價閉合環狀分子。當pH值為 12.0-12.6,堿性環境中,線性的大分子的染色體DNA完全變性且無法復性,而共價閉環質粒DNA在將PH調至中性后即可恢復其天然構象;在高鹽濃度存在的條件下,染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀,而質粒DNA為可溶狀態,通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質,質粒DNA仍在上清中。殘留的雜質可以通過酚lv仿處理掉。

 

實驗過程

1、實驗試劑

(1)溶液Ⅰ 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=8.0;

(2)溶液Ⅱ 0.2Ml NaOH / 1% SDS;

(3)溶液Ⅲ 3Ml 醋酸鉀 / 2Ml 醋酸;

(4)異丙醇,無水乙醇,75%乙醇應放-20℃冰箱預冷備用;

酚lv仿放4℃冰箱預存;

(5)搖菌,2-3ml相應抗性的LB培養液,在37℃溫度下過夜培養。

 

2、質粒提取

(1)菌液12000rcf離心5min,棄掉上清,加入0.2ml溶液I(已加入RNase),充分混勻后,加入0.25ml溶液II,顛倒混勻,室溫放置5min,加入0.4ml 溶液III,顛倒混勻后,13000rcf 離心30min。

(2)上清轉入新的1.5mlEP管中,加入等體積的酚lv仿混合液,充分混勻。10000rcf 離心10min。

(3)取上清,轉入新的EP管,加入等體積、預冷的異丙醇,充分混勻后,13000rcf 離心 6min。

(4)倒掉上清液,用1ml預冷的75%乙醇,顛倒后,13000rcf 離心 1min。

(5)倒掉上清液,沿壁加入1ml預冷的75%乙醇,直接倒掉。

(6)沿壁加入1ml預冷的乙醇,直接倒掉。倒扣5min后,室溫下放置10min。

待管內液體會發干凈后,向管內加入100ul水,55℃孵育5min。

      (7)所得質粒溶液可以放入-20℃中長期保存。

 

 

注意事項

  1. 若菌株為革蘭氏陽性菌,該菌有一層細胞壁,必須加入溶菌酶才能使之溶解。

  2. 搖床速度不宜過高。達到OD600 1.5即可。

  3. 溶液I加入RNase后需要放在4℃中保存,以防酶失活。

  4. 溶液II和溶液III使用前需注意觀察是否有沉淀,如有沉淀可37℃水浴處理。

  5. 溶液II處理菌體時間應控制在5分鐘以內。

 

常見問題及解決方法

常見問題

原因

解決辦法

質粒濃度低

溶液處理不充分

增加溶液I/II/III的加入量,或降低菌液體積。

 

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增加搖菌量,并降低hou的溶解體積

 

菌體老化

重新質粒轉化或劃線后挑取單克隆搖菌

 

乙醇殘留

乙醇的存在會影響質粒的溶解和回收,須延長乙醇揮發時間

 

洗脫液不合適

可配置合適的EB(10mM Tris-HCl, 1mMEDTA,pH8.5)

 

洗脫體積較小

在保證質粒濃度的前提下,增加洗脫液的體積

質粒有雜帶

菌液污染

重新質粒轉化或劃線后挑取單克隆搖菌

 

試劑污染

質粒提取溶液重新配置,hou溶解液高壓滅菌后使用

 

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