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技術支持

如何進行質粒構建? ------古朵新聞√
發布時間:2020-03-17   點擊次數:534次

1.載體構建

載體構建(vectorconstruction):載體構建是分子生物學研究常用的手段之一。主要包括已有載體多克隆位點(MCS)的改造和已有載體啟動子、增強子、篩選標記等功能元件的改造。是為把DNA分子運送到受體細胞中去,必須尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的DNA片段后仍能照樣復制的運載體。理想的運載體是質粒(plasmid),在基因工程中,常用人工構建的質粒作為載體。載體構建即是構建含外源DNA的質粒。

特點:當給質粒插入一段外源DNA片段后,它依然能夠進行自我復制。

2.多克隆位點

多克隆位點(multiple cloning site, MCS),指的是包含數個(zui多20個)限制性酶切位點(restriction site)的一段很短的DNA序列。也稱為多位點接頭(polylinker),是基因工程中常用到的載體質粒的標準配置序列。MCS上含有多個單一酶切位點,是外源DNA的插入部位,每個限制性酶切位點通常是唯1的,即它們在一個特定的載體質粒中只出現一次。不同酶的酶切位點可有重疊。單一酶切位點就是只有一種特定的酶能夠識別并進行酶切的位點,多克隆位點一般是位于質粒上的一段序列,這段序列含有很多個酶切位點,但這些酶切位點每一個都被一種酶識別并酶切。

3.質粒構建

(1)質粒構建原理

質粒構建是分子生物學研究中zui常用的實驗技術。原理依賴于限制性核酸內切酶,DNA連接酶和其他修飾酶的作用,分別對目的基因和載體DNA進行適當切割和修飾后,將二者連接在一起,再導入宿主細胞,實現目的基因在宿主細胞內的正確表達。

(2)質粒構建方式

質粒構建方式多樣,常規的T4連接酶,下面就介紹下T4連接酶構建質粒方法,T4連接酶可用于平末端也可用于粘性末端連接,但一般推薦適用黏性末端。

(3)質粒載體的制備

質粒載體的制備既可以選擇單酶切也可以選擇雙酶切,一般推薦使用雙酶切。其實目的就只有一個,盡量使載體的末端具有特異性,防止自連。


4.一般目的基因用于克隆表達的情況下,酶切位點的選擇要考慮到:

(1)選擇質粒上兩個酶切位點的距離不應小于太?。?gt;10bp),否則影響限制性內切酶對切點的識別,不利于空載體的雙酶切。

(2)一般目的基因用于克隆表達的情況下,酶切位點的選擇要考慮到:

目的基因片段內部不含有所選的酶切位點(不然鑒定陽性重組子雙酶切時會將目的基因切斷)。

(3)實驗后繼應用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲)都盡可能含有所選的酶切位點。并且要保證在載體上的插入方向正確(定向克?。?。(不然換載體表達時,還要重新設計引物,以引進新的酶切位點)。

(4)盡可能選比較常用的酶切位點(常用切點酶的價格比較便宜)。

(5)兩個酶切點至少隔上3個堿基。

(6)兩個酶切點不要是同尾酶(切下來的殘基不要互補),否則效果相當于單酶切。

(7)使用酶切效率高的酶。

(8)使用雙酶切有共同buffer的酶。

注:質粒構建完成后可利用PCR原理進行測序驗證。

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